*§ 10-1. Методы изучения клетки
Разделение компонентов клеток. Для изучения строения и функций отдельных клеточных структур — ядер, различных органелл и др. — необходимо отделить их друг от друга. С этой целью клетки помещают в буферный раствор, соответствующий гиалоплазме по рН и концентрации солей. Затем разрушают цитоплазматические мембраны клеток для получения суспензии клеточных компонентов. При этом важно, чтобы ядра и органоиды разрушенных клеток остались неповрежденными.
Для получения суспензии часто используют гомогенизатор — специальный аппарат, в котором пестик вращается в стеклянном цилиндре (рис. 10-1.2). Разрушение клеток осуществляется в зазоре между стенкой сосуда и пестиком.
Разрушить клетки можно также путем их многократного замораживания и оттаивания (при этом разрыв клеток происходит за счет образования в них кристаллов льда) либо действием ультразвука.
Из курса химии вы знаете, что суспензии можно разделять отстаиванием, однако для отделения очень маленьких частиц одной силы тяжести недостаточно. Поэтому разделение компонентов клеток осуществляют преимущественно методом дифференциального (разделительного) центрифугирования в специальных приборах — центрифугах. В них пробирки с исследуемой суспензией клеточных структур вращаются с высокой скоростью. При этом возникает центробежная сила, в сотни и тысячи раз большая, чем сила тяжести. Под ее действием и происходит осаждение частиц.
Ступенчатое увеличение скорости вращения пробирок приводит к последовательному осаждению различных компонентов клеток. Сначала осаждаются самые крупные и плотные, затем — меньшие по размеру и менее плотные.
Первое центрифугирование суспензии клеточных структур проводят при низкой скорости вращения. На дне пробирок образуется осадок, в основном содержащий ядра клеток. Надосадочную жидкость переносят в другие пробирки и центрифугируют с более высокой скоростью. Повторение этих операций с увеличением скорости центрифугирования на каждом этапе позволяет разделить компоненты клеток (рис. 10-1.3). Жидкая фаза последнего центрифугирования представляет собой гиалоплазму.
Скорость осаждения частиц при центрифугировании выражают в единицах Сведберга — S. Для частицы, которая осаждается быстрее, значение S будет больше. Обозначение единицы S нередко добавляют в названия клеточных структур. Например, так называемые 80S рибосомы эукариот крупнее и быстрее осаждаются, чем 70S рибосомы прокариот.
Скорость осаждения зависит от размера частицы, ее плотности и формы. Поэтому две частицы одинакового размера могут иметь разные значения S, если они имеют разную плотность или форму. Кроме того, когда две частицы связываются вместе, величина S образовавшегося комплекса не будет равна сумме S исходных частиц.
Органеллы и даже макромолекулы, незначительно различающиеся по размеру и плотности, можно разделить методом центрифугирования в градиенте плотности. Анализируемая проба наслаивается тонким слоем на раствор сахарозы или хлорида цезия. Причем концентрация и, следовательно, плотность этого раствора возрастает от поверхности пробирки к ее дну. В процессе центрифугирования частицы проходят через раствор и «останавливаются» в определенном слое жидкости. Это дает возможность отделить одни частицы от других (рис. 10-1.4).
