*§ 10-1. Методы изучения клетки

Световая микроскопия. Первым методом, использованным для открытия и изучения клеток, была световая микроскопия. Увеличение объекта в световом микроскопе достигается с помощью линз, через которые проходит свет. При этом максимальное увеличение составляет около 1500 раз. Однако главной характеристикой микроскопа является разрешающая способность (разрешение) — минимальное расстояние между двумя объектами, которые можно распознать отдельно. Отдельная частица будет видна только в том случае, если по размеру она не меньше разрешения микроскопа. Например, разрешающая способность человеческого глаза составляет около 0,1 мм.

Разрешение светового микроскопа ограничивается длиной световой волны. Даже при использовании самого коротковолнового видимого света — фиолетового — можно достичь разрешения лишь около 200 нм. При такой разрешающей способности видны самые крупные компоненты клеток — ядро, пластиды, вакуоли, митохондрии, клеточные стенки. Более мелкие клеточные структуры или не видны вообще, или их детали различаются с трудом.

Другая трудность применения световой микроскопии состоит в том, что большинство клеточных компонентов прозрачно. Для увеличения контрастности часто используют различные методы окраски клеток. При этом клеточные структуры окрашиваются специальными красителями в разные цвета. Некоторые красители — их называют прижизненными — не токсичны и используются для окрашивания живых клеток. Однако большинство красителей токсично для клеток и вызывает их гибель.

Электронная микроскопия. Многие клеточные структуры, например рибосомы, диаметр которых составляет около 20—30 нм, невозможно увидеть с помощью светового микроскопа из-за низкого разрешения. Эта проблема была решена после создания электронного микроскопа в 1930-х гг. Вместо света в нем используется поток электронов, а вместо линз — электромагниты. Современные электронные микроскопы (рис. 10-1.1) имеют разрешающую способность менее 1 нм и увеличение до 10⁶ раз. Этого достаточно для изучения мельчайших органоидов и даже крупных молекул. Использование электронной микроскопии в биологии позволило исследовать ультратонкое строение клеточных структур — мембран, рибосом, элементов цитоскелета и др.

С помощью методов цитохимии и гистохимии изучают химическую природу различных структур клеток и тканей, распределение химических соединений, их локализацию и превращения. Эти методы основаны на использовании цветных реакций для определения в клетках различных веществ. Под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание определенных соединений в клетке. По степени и характеру окраски с помощью микроскопии судят о количестве или активности изучаемых веществ.

Методы цито- и гистохимии должны обеспечивать связывание красителя только с исследуемым соединением, сохранение структуры клетки и локализации вещества в ней. Благодаря этим методам обнаруживают белки и аминокислоты, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, неорганические вещества и др.

Важную роль в цитохимических исследованиях играет авторадиография. Этот метод основан на введении в клетки веществ, содержащих радиоактивные метки (³H, ¹⁴С, ¹⁵N, ³²P, ¹³¹I и др.). По химическим свойствам меченые соединения, например аминокислоты или углеводы, не отличаются от обычных и включаются в процессы обмена веществ. Установить локализацию и концентрацию меченых веществ можно благодаря потемнению чувствительной к радиоактивным излучениям фотографической эмульсии, наложенной на образец. Метод авторадиографии используется для изучения процессов обмена веществ в клетке, определения локализации отдельных веществ и перемещения их внутри клетки, исследования проницаемости клеточных мембран.

Разделение компонентов клеток. Для изучения строения и функций отдельных клеточных структур — ядер, различных органелл и др. — необходимо отделить их друг от друга. С этой целью клетки помещают в буферный раствор, соответствующий гиалоплазме по рН и концентрации солей. Затем разрушают цитоплазматические мембраны клеток для получения суспензии клеточных компонентов. При этом важно, чтобы ядра и органоиды разрушенных клеток остались неповрежденными.

Из курса химии вы знаете, что суспензии можно разделять отстаиванием, однако для отделения очень маленьких частиц одной силы тяжести недостаточно. Поэтому разделение компонентов клеток осуществляют преимущественно методом дифференциального (разделительного) центрифугирования в специальных приборах — центрифугах. В них пробирки с исследуемой суспензией клеточных структур вращаются с высокой скоростью. При этом возникает центробежная сила, в сотни и тысячи раз большая, чем сила тяжести. Под ее действием и происходит осаждение частиц.

Ступенчатое увеличение скорости вращения пробирок приводит к последовательному осаждению различных компонентов клеток. Сначала осаждаются самые крупные и плотные, затем — меньшие по размеру и менее плотные.

Первое центрифугирование суспензии клеточных структур проводят при низкой скорости вращения. На дне пробирок образуется осадок, в основном содержащий ядра клеток. Надосадочную жидкость переносят в другие пробирки и центрифугируют с более высокой скоростью. Повторение этих операций с увеличением скорости центрифугирования на каждом этапе позволяет разделить компоненты клеток (рис. 10-1.3). Жидкая фаза последнего центрифугирования представляет собой гиалоплазму.

Скорость осаждения частиц при центрифугировании выражают в единицах Сведберга — S. Для частицы, которая осаждается быстрее, значение S будет больше. Обозначение единицы S нередко добавляют в названия клеточных структур. Например, так называемые 80S рибосомы эукариот крупнее и быстрее осаждаются, чем 70S рибосомы прокариот.

Органеллы и даже макромолекулы, незначительно различающиеся по размеру и плотности, можно разделить методом центрифугирования в градиенте плотности. Анализируемая проба наслаивается тонким слоем на раствор сахарозы или хлорида цезия. Причем концентрация и, следовательно, плотность этого раствора возрастает от поверхности пробирки к ее дну. В процессе центрифугирования частицы проходят через раствор и «останавливаются» в определенном слое жидкости. Это дает возможность отделить одни частицы от других (рис. 10-1.4).

Другие методы изучения клетки. Для исследования строения молекул применяется рентгеноструктурный анализ. С его помощью можно определить длину химических связей, размер атомов и их пространственное расположение в молекулах. С использованием этого метода установлена структура многих биологических молекул — белков, нуклеиновых кислот, витаминов и т. д.

Метод клеточных культур представляет собой выращивание клеток на специальных питательных средах в контролируемых условиях. Для этого  необходимо обеспечить стерильность, а питательная среда должна содержать все вещества, нужные для обеспечения жизнедеятельности выращиваемых клеток. Культивирование клеток осуществляется при постоянной температуре, поддерживается определенная концентрация кислорода, углекислого газа, паров воды и т. д. Метод клеточных культур используется для изучения процессов деления и роста клеток, их дифференцировки, взаимодействия со средой, старения, злокачественной трансформации и др.

Методы микрохирургии позволяют удалять или пересаживать структурные элементы живых клеток, например ядра, органоиды, осуществлять микроинъекции разных веществ. Эти методы применяют для изучения роли ядра и различных органелл в жизни клеток, исследования изменений, происходящих в безъядерных клетках и др.