*§ 10-1. Методы изучения клетки

Световая микроскопия. Первым методом, использованным для открытия и изучения клеток, была световая микроскопия. Увеличение объекта в световом микроскопе достигается с помощью линз, через которые проходит свет. При этом максимальное увеличение составляет около 1500 раз. Однако главной характеристикой микроскопа является разрешающая способность (разрешение) — минимальное расстояние между двумя объектами, которые можно распознать отдельно. Отдельная частица будет видна только в том случае, если по размеру она не меньше разрешения микроскопа. Например, разрешающая способность человеческого глаза составляет около 0,1 мм.

 

            Разрешение характеризует четкость изображения. Без повышения разрешающей способности нет смысла в большем увеличении. Если линзы не дают возможности различать детали объекта, то изображение будет размытым, и при большем увеличении будет получено просто более крупное, но такое же нечеткое изображение.

        

Разрешение светового микроскопа ограничивается длиной световой волны. Даже при использовании самого коротковолнового видимого света — фиолетового — можно достичь разрешения лишь около 200 нм. При такой разрешающей способности видны самые крупные компоненты клеток — ядро, пластиды, вакуоли, митохондрии, клеточные стенки. Более мелкие клеточные структуры или не видны вообще, или их детали различаются с трудом.

         Другая трудность применения световой микроскопии состоит в том, что большинство клеточных компонентов прозрачно. Для увеличения контрастности часто используют различные методы окраски клеток. При этом клеточные структуры окрашиваются специальными красителями в разные цвета. Некоторые красители — их называют прижизненными — не токсичны и используются для окрашивания живых клеток. Однако большинство красителей токсично для клеток и вызывает их гибель.

С помощью методов цитохимии и гистохимии изучают химическую природу различных структур клеток и тканей, распределение химических соединений, их локализацию и превращения. Эти методы основаны на использовании цветных реакций для определения в клетках различных веществ. Под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание определенных соединений в клетке. По степени и характеру окраски с помощью микроскопии судят о количестве или активности изучаемых веществ.

Методы цито- и гистохимии должны обеспечивать связывание красителя только с исследуемым соединением, сохранение структуры клетки и локализации вещества в ней. Благодаря этим методам обнаруживают белки и аминокислоты, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, неорганические вещества и др.

При цитохимическом определении белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов, как правило, выявляются определенные структурные части их молекул. Например, в нуклеиновых кислотах — азотистые основания, остатки фосфорной кислоты или пентоз. Определение ферментов основано на выявлении продуктов катализируемых ими реакций. При этом клетки помещаются в среду, содержащую субстрат исследуемого фермента, а образующийся продукт определяется при помощи цветной реакции. Окрашенный продукт не должен обладать высокой растворимостью, чтобы располагаться именно в тех частях клетки, где он был синтезирован. По интенсивности окраски можно определить уровень активности фермента. В настоящее время методы цитохимии позволяют выявлять множество различных ферментов.

Важную роль в цитохимических исследованиях играет авторадиография. Этот метод основан на введении в клетки веществ, содержащих радиоактивные метки (3H, 14С, 15N, 32P, 131I и др.). По химическим свойствам меченые соединения, например аминокислоты или углеводы, не отличаются от обычных и включаются в процессы обмена веществ. Установить локализацию и концентрацию меченых веществ можно благодаря потемнению чувствительной к радиоактивным излучениям фотографической эмульсии, наложенной на образец. Метод авторадиографии используется для изучения процессов обмена веществ в клетке, определения локализации отдельных веществ и перемещения их внутри клетки, исследования проницаемости клеточных мембран.