*§ 10-1. Метады вывучэння клеткі
Световая микроскопия. Первым методом, использованным для открытия и изучения клеток, была световая микроскопия. Увеличение объекта в световом микроскопе достигается с помощью линз, через которые проходит свет. При этом максимальное увеличение составляет около 1500 раз. Однако главной характеристикой микроскопа является разрешающая способность (разрешение) — минимальное расстояние между двумя объектами, которые можно распознать отдельно. Отдельная частица будет видна только в том случае, если по размеру она не меньше разрешения микроскопа. Например, разрешающая способность человеческого глаза составляет около
|
Разрешение характеризует четкость изображения. Без повышения разрешающей способности нет смысла в большем увеличении. Если линзы не дают возможности различать детали объекта, то изображение будет размытым, и при большем увеличении будет получено просто более крупное, но такое же нечеткое изображение. |
Разрешение светового микроскопа ограничивается длиной световой волны. Даже при использовании самого коротковолнового видимого света — фиолетового — можно достичь разрешения лишь около 200 нм. При такой разрешающей способности видны самые крупные компоненты клеток — ядро, пластиды, вакуоли, митохондрии, клеточные стенки. Более мелкие клеточные структуры или не видны вообще, или их детали различаются с трудом.
Другая трудность применения световой микроскопии состоит в том, что большинство клеточных компонентов прозрачно. Для увеличения контрастности часто используют различные методы окраски клеток. При этом клеточные структуры окрашиваются специальными красителями в разные цвета. Некоторые красители — их называют прижизненными — не токсичны и используются для окрашивания живых клеток. Однако большинство красителей токсично для клеток и вызывает их гибель.
| Site: | Профильное обучение |
| Course: | Біялогія. 11 клас |
| Book: | *§ 10-1. Метады вывучэння клеткі |
| Printed by: | Guest user |
| Date: | Tuesday, 10 December 2024, 11:21 AM |
Светлавая мікраскапія. Першым метадам, выкарыстаным для адкрыцця і вывучэння клетак, была светлавая мікраскапія. Павелічэнне аб'екта ў светлавым мікраскопе дасягаецца з дапамогай лінз, праз якія праходзіць святло. Пры гэтым максімальнае павелічэнне складае каля 1500 разоў. Аднак галоўнай характарыстыкай мікраскопа з'яўляецца распазнавальная здольнасць — мінімальная адлегласць паміж двума аб'ектамі, якія можна распазнаць асобна. Асобная часціца будзе бачна толькі ў тым выпадку, калі па памеры яна не меншая за распазнавальнасць мікраскопа. Напрыклад, распазнавальная здольнасць чалавечага вока складае каля 0,1 мм.
Распазнавальнасць характарызуе выразнасць відарыса. Без павышэння распазнавальнай здольнасці няма сэнсу ў большым павелічэнні. Калі лінзы не даюць магчымасці адрозніваць дэталі аб'екта, то відарыс будзе размытым, і пры большым павелічэнні будзе атрыманы проста больш буйны, але такі ж невыразны відарыс.
Распазнавальнасць светлавога мікраскопа абмяжоўваецца даўжынёй светлавой хвалі. Нават пры выкарыстанні самага караткахвалевага бачнага святла — фіялетавага — можна дасягнуць распазнавальнасці толькі каля 200 нм. Пры такой распазнавальнай здольнасці можна ўбачыць самыя буйныя кампаненты клетак — ядро, пластыды, вакуолі, мітахондрыі, клетачныя сценкі. Больш дробныя клетачныя структуры ці не бачны ўвогуле, ці іх дэталі распазнаюцца з цяжкасцю.
Другая складанасць ужывання светлавой мікраскапіі выяўляецца ў тым, што большасць клетачных кампанентаў празрыстая. Для павелічэння кантраснасці часта выкарыстоўваюць розныя метады афарбоўкі клетак. Пры гэтым клетачныя структуры афарбоўваюцца спецыяльнымі фарбавальнікамі ў розныя колеры. Некаторыя фарбавальнікі — іх называюць прыжыццёвымі — не таксічныя і выкарыстоўваюцца для афарбоўвання жывых клетак. Аднак большасць фарбавальнікаў таксічныя для клетак і выклікаюць іх гібель.
Электронная мікраскапія. Многія клетачныя структуры, напрыклад рыбасомы, дыяметр якіх складае каля 20—30 нм, немагчыма ўбачыць з дапамогай светлавога мікраскопа з прычыны нізкай распазнавальнасці. Гэта праблема была рэшана пасля стварэння электроннага мікраскопа ў 1930-х гг. Замест святла ў ім выкарыстоўваецца струмень электронаў, а замест лінз — электрамагніты. Сучасныя электронныя мікраскопы (мал. 10-1.1) маюць распазнавальную здольнасць, меншую за 1 нм і павелічэнне да 106 разоў. Гэтага дастаткова для вывучэння найдрабнейшых арганоідаў і нават буйных малекул. Выкарыстанне электроннай мікраскапіі ў біялогіі дазволіла даследаваць ультратонкую будову клетачных структур — мембран, рыбасом, элементаў цыташкілета і інш.
Адрозніваюць два асноўныя тыпы электроннай мікраскапіі: прасвечвальную (трансмісійную) і сканіруючую. У прасвечвальным электронным мікраскопе электроны праходзяць праз узор, гэтак жа як светлавыя прамені ў светлавым мікраскопе. Таму для вывучэння можна выкарыстоўваць толькі вельмі тонкія зрэзы, каб праз іх маглі праходзіць электроны. Акрамя таго, у такім мікраскопе падтрымліваецца вакуум, а біялагічныя ўзоры для павелічэння кантраснасці апрацоўваюць злучэннямі ўрану ці свінцу, якія з'яўляюцца таксічнымі для клетак. З гэтым звязана тое, што з дапамогай прасвечвальнага электроннага мікраскопа можна вывучаць толькі мёртвыя клеткі.
Сканіруючы электронны мікраскоп вынайдзены ў 1950-х гг. Відарыс у ім ствараецца адбітымі ад паверхні вывучанага аб'екта электронамі, пры гэтым можна выкарыстоўваць узоры большай таўшчыні. Распазнавальная здольнасць сканіруючы электроннай мікраскапіі ніжэйшая, чым прасвечвальнай. Але гэты метад дазваляе атрымліваць трохмерныя відарысы. З яго дапамогай даследуюцца, напрыклад, мембраны клетак і ўключаныя ў іх бялкі.
З дапамогай метадаў цытахіміі і гістахіміі вывучаюць хімічную прыроду розных структур клетак і тканак, размеркаванне хімічных злучэнняў, іх лакалізацыю і ператварэнні. Гэтыя метады заснаваны на выкарыстанні колеравых рэакцый для вызначэння ў клетках розных рэчываў. Пад дзеяннем спецыяльна падабраных рэактываў адбываецца афарбоўванне пэўных злучэнняў у клетцы. Па ступені і характары афарбоўкі з дапамогай мікраскапіі мяркуюць пра колькасць ці актыўнасць вывучаемых рэчываў.
Метады цыта- і гістахіміі павінны забяспечваць звязванне фарбавальніку толькі з доследным злучэннем, захаванне структуры клеткі і лакалізацыі рэчыва ў ёй. Дзякуючы гэтым метадам выяўляюць бялкі і амінакіслоты, нуклеінавыя кіслоты, вугляводы, ліпіды, неарганічныя рэчывы і інш.
Пры цытахімічным вызначэнні бялкоў, нуклеінавых кіслот, вугляводаў і ліпідаў, як правіла, выяўляюцца пэўныя структурныя часткі іх малекул. Напрыклад, у нуклеінавых кіслотах — азоцістыя асновы, астаткі фосфарнай кіслаты ці пентоз. Вызначэнне ферментаў заснавана на выяўленні прадуктаў каталізуемых імі рэакцый. Пры гэтым клеткі змяшчаюцца ў асяроддзе, якое, утрымлівае субстрат доследнага ферменту, а прадукт, што ўтвараецца, вызначаецца з дапамогай колеравай рэакцыі. Афарбаваны прадукт не павінен валодаць высокай растваральнасцю, каб змяшчацца менавіта ў тых частках клеткі, дзе ён быў сінтэзаваны. Па інтэнсіўнасці афарбоўкі можна вызначыць узровень актыўнасці ферменту. У цяпершні час метады цытахіміі дазваляюць выяўляць мноства розных ферментаў.
Важную ролю ў цытахімічных даследаваннях адыгрывае аўтарадыяграфія. Гэты метад заснаваны на ўвядзенні ў клеткі рэчываў, якія змяшчаюць радыеактыўныя меткі (3H,
Раздзяленне кампанентаў клетак. Для вывучэння будовы і функцый асобных клетачных структур — ядзер, розных арганэл і інш., неабходна аддзяліць іх адна ад адной. З гэтай мэтай клеткі змяшчаюць у буферны раствор, што адпавядае гіялаплазме па рН і канцэнтрацыі солей. Потым разбураюць цытаплазматычныя мембраны клетак для атрымання суспензіі клетачных кампанентаў. Пры гэтым важна, каб ядры і арганоіды разбураных клетак засталіся непашкоджанымі.
Для атрымання суспензіі можна выкарыстоўваць гомагенізатар — спецыяльны апарат, у якім песцік верціцца ў шкляным цыліндры (мал. 10-1.2). Разбурэнне клетак ажыццяўляецца ў зазоры паміж сценкай сасуда і песцікам.
Разбурыць клеткі можна таксама шляхам іх шматразовага замарожвання і адтавання (пры гэтым разрыў клетак адбываецца за кошт утварэння ў іх крышталёў лёду) або дзеяннем ультрагуку.
З курса хіміі вы ведаеце, што суспензіі можна раздзяляць адстойваннем, аднак для аддзялення вельмі маленькіх часціц адной сілы цяжару недастаткова. Таму раздзяленне кампанентаў клетак ажыццяўляюць пераважна метадам дыферэнцыяльнага (раздзяляльнага) цэнтрыфугавання ў спецыяльных прыборах — цэнтрыфугах. У іх прабіркі з доследнай суспензіяй клетачных структур круцяцца з высокай хуткасцю. Пры гэтым узнікае цэнтрабежная сіла, у сотні і тысячы разоў большая, чым сіла цяжару. Пад яе дзеяннем і адбываецца асяданне часціц.
Ступеньчатае павелічэнне хуткасці кручэння прабірак прыводзіць да паслядоўнага асаджэння розных кампанентаў клетак. Спачатку асядаюць самыя буйныя і шчыльныя, потым — меншыя па памеры і менш шчыльныя.
Першае цэнтрыфугаванне суспензіі клетачных структур праводзяць пры нізкай хуткасці кручэння. На дне прабірак утвараецца асадак, які ў асноўным змяшчае ядры клетак. Надасадкавую вадкасць пераносяць у іншыя прабіркі і цэнтрыфугуюць з больш высокай хуткасцю. Паўтарэнне гэтых аперацый з павелічэннем хуткасці цэнтрыфугавання на кожным этапе дазваляе падзяліць кампаненты клетак (мал. 10-1.3). Вадкая фаза апошняга цэнтрыфугавання ўяўляе сабой гіялаплазму.
Хуткасць асаджэння часціц пры цэнтрыфугаванні выражаюць у адзінках Сведберга — S. Для часціцы, якая асядае хутчэй, значэнне S будзе большым. Абазначэнне адзінкі S нярэдка дабаўляюць у назвы клетачных структур. Напрыклад, так званыя 80S рыбасомы эўкарыёт буйней і хутчэй асядаюць, чым 70S рыбасомы пракарыёт.
Хуткасць асаджэння залежыць ад памеру часціцы, яе шчыльнасці і формы. Таму дзве часціцы аднолькавага памеру могуць мець розныя значэнні S, калі яны маюць розную шчыльнасць ці форму. Акрамя таго, калі дзве часціцы звязваюцца разам, велічыня S утворанага комплексу не будзе роўная суме S зыходных часціц.
Арганэлы і нават макрамалекулы, што нязначна адрозніваюцца па памеры і шчыльнасці, можна раздзяліць метадам цэнтрыфугавання ў градыенце шчыльнасці. Аналізуемая проба наслойваецца тонкім слоем на раствор цукрозы ці хларыду цэзію. Прычым канцэнтрацыя і, такім чынам, шчыльнасць гэтага раствору ўзрастаюць ад паверхні прабіркі да яе дна. У працэсе цэнтрыфугавання часціцы праходзяць праз раствор і «спыняюцца» ў пэўным слоі вадкасці. Гэта дае магчымасць аддзяліць адны часціцы ад другіх (мал. 10-1.4).
Іншыя метады вывучэння клеткі. Для вывучэння будовы малекул ужываецца рэнтгенаструктурны аналіз. З яго дапамогай можна вызначыць даўжыню хімічных сувязей, памер атамаў і іх прасторавае размяшчэнне ў малекулах. З выкарыстаннем гэтага метаду была вызначана структура многіх біялагічных малекул — бялкоў, нуклеінавых кіслот, вітамінаў і г. д.
За даследаванні прасторавай структуры і функцый біямалекул з выкарыстаннем рэнтгенаструктурнага аналізу 19 вучоных былі ўзнагароджаны Нобелеўскай прэміяй. У іх ліку ўжо вядомыя вам Д. Уотсан, Ф. Крык і М. Уілкінс, якія вызначылі структуру ДНК, а таксама Д. Ходжкін за адкрыццё структуры халестэрыну, пеніцыліну і вітаміну В12 (1964 г.), А. Ёнат, Т. Стэйц і У. Рамакрышнан за даследаванні будовы і функцый рыбасом (2009 г.) і інш.
Метад клетачных культур уяўляе сабой вырошчванне клетак на спецыяльных пажыўных асяроддзях у кантралюемых умовах. Для гэтага трэба забяспечыць стэрыльнасць, а пажыўнае асяроддзе павінна змяшчаць усе рэчывы, патрэбныя для забеспячэння жыццядзейнасці клетак, якія вырошчваюцца. Культываванне клетак ажыццяўляецца пры пастаяннай тэмпературы, падтрымліваецца пэўная канцэнтрацыя кіслароду, вуглякіслага газу, пары вады і г. д. Метад клетачных культур выкарыстоўваецца для вывучэння працэсаў дзялення і росту клетак, іх дыферэнцыроўкі, узаемадзеяння з асяроддзем, старэння, злаякаснай трансфармацыі і інш.
Метады мікрахірургіі дазваляюць выдаляць ці перасаджваць структурныя элементы жывых клетак, напрыклад ядры, арганоіды, ажыццяўляць мікраін'екцыі розных рэчываў. Гэтыя метады прымяняюць для вывучэння ролі ядра і розных арганэл у жыцці клетак, даследавання змяненняў, якія адбываюцца ў бяз'ядзерных клетках і інш.
Адкрыццё клетак звязана з выкарыстаннем светлавой мікраскапіі. Гэты метад дазваляе вывучыць самыя буйныя клетачныя кампаненты. Ужыванне электроннай мікраскапіі зрабіла магчымым даследаванне ультратонкай будовы клетачных структур. Метады цыта- і гістахіміі выкарыстоўваюцца для вывучэння лакалізацыі хімічных злучэнняў і аналізу працэсаў абмену рэчываў у клетках і тканках. Вызначыць прасторавую структуру біямалекул дазваляе рэнтгенаструктурны аналіз. Метады дыферэнцыяльнага цэнтрыфугавання і цэнтрыфугавання ў градыенце шчыльнасці ўжываюць для раздзялення кампанентаў клетак. Пры вывучэнні працэсаў дзялення і росту, дыферэнцыяцыі, ролі ядра і арганоідаў у жыццядзейнасці клетак выкарыстоўваюць метады клетачных культур і мікрахірургіі.
 |
1. Ахарактарызуйце метады светлавой і электроннай мікраскапіі. Што яны дазваляюць вывучыць? 2. На чым заснаваны метады цыта- і гістахіміі? Для чаго яны ўжываюцца? Што ўяўляе сабой аўтарадыяграфія? 3. Ахарактарызуйце метад дыферэнцыяльнага цэнтрыфугавання. У чым заключаецца асаблівасць цэнтрыфугавання ў градыенце шчыльнасці? 4. У якіх адзінках выражаюць хуткасць асаджэння часціц пры цэнтрыфугаванні? Ці можна падзяліць кампаненты суспензіі, якія маюць аднолькавыя памеры, з дапамогай цэнтрыфугі? 5. Для чаго выкарыстоўваецца метад рэнтгенаструктурнага аналізу? 6. На чым заснаваны і для чаго выкарыстоўваюцца метады клетачных культур і мікрахірургіі? 7*. Падбярыце метады, якія падыходзяць для кожнага цыталагічнага даследавання. Растлумачце свой выбар. а) Вызначэнне таўшчыні цытаплазматычнай мембраны клеткі; б) выдзяленне з нейронаў ядзер і іх збор у асобную прабірку для далейшага вывучэння; в) падлік колькасці лейкапластаў (бясколерных пластыд) у клетках клубня бульбы; г) вызначэнне формы малекулы бялку і пабудова яе аб'ёмнага відарыса; д) размнажэнне ў лабараторыі лейкацытаў чалавека і вызначэнне, ці змогуць яны выконваць свае функцыі без ядра; е) падлік колькасці эрытрацытаў у 1 мм3 крыві чалавека. 8*. У цяпершні час метад клетачных культур знаходзіць прымяненне не толькі ў цыталагічных даследаваннях. Прапануйце іншыя магчымыя галіны яго практычнага выкарыстання. |